利用層析柱將混合物各組分分離開來的操作過程稱為柱層析。柱層析是層析技術中的一類，依據(jù)其作用原理又可分為吸附柱層析(原理見第97～100頁和第101～102頁)、分配柱層析(原理見第91～92及94～95頁)和離子交換柱層析等。其中以吸附柱層析應用**廣。以下只介紹吸附柱層析的相關問題，其操作方法也可作為其他類型柱層析的參考。
1.吸附柱層析的器材(1)層析柱
實驗室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管，如圖3-3**所示，活塞的芯**好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞，則真空油脂要小心地涂薄涂勻。另一種是將玻璃管下端拉細，套上一段彈性良好的管子。這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因為橡皮易被氯仿、苯、THF等溶劑溶脹，而聚乙烯管子對大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，如圖3-35b所示。此外，薄膜塑料柱如圖3-35c，因使用方便、節(jié)省淋洗劑、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點，應用日趨廣泛。薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的，兩側常有很深的折痕。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊。將這段玻璃管穿過一個單孔塞。然后將薄膜管放進一根又粗又長，下端拉細了的玻璃管內，使塞子塞緊大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內部壓強大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個小孔即可使用。
層析柱的尺寸根據(jù)被分離物的量來確定，其直徑與高度之比則根據(jù)被分離混合物的分離難易而定，一般在1∶8到1∶50之間。柱身細長，分離效果好，但可分離的量小，且分離所需時間長；柱身短粗，分離效果較差，但一次可以分離較多的樣品，且所需時間短。如果待分離物各組分較難分離，宜選用細長的柱子，如果要處理大量的較易分離的或對分離純度要求較低的混合物，則可選用粗而短的柱子。**常使用的層析柱，直徑與長度之比在1∶8到1∶15之間。
(2)吸附劑
柱層析中**常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。其用量為被分離樣品的30～50倍，對于難以分離的混合物，吸附劑的用量可達100倍或更高。對于吸附劑應綜合考慮其種類、酸堿性、粒度及活性等因素，**后用實驗方法選擇和確定。市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗到其浸出液的pH值為4，適用于分離酸性物質；堿性氧化鋁浸出液的pH值為9～10，用以分離胺類、生物堿及其他有機堿性化合物。中性氧化鋁的相應pH值為7.5，適合于醛、酮、醌、酯等類化合物的分離以及對酸、堿敏感的其他類型化合物的分離。硅膠沒有酸堿性之分，可適用于各類有機物的分離。柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100～150目，硅膠為60～100目，如果顆粒太小，淋洗劑在其中流動太慢，甚**流不出來。
氧化鋁和硅膠的活性各分五個等級(見表2-5)。哪個活性級別分離效果**好，要用實驗方法確定，而不是盲目選擇高的活性級別，**常使用的是Ⅱ～Ⅲ級。如果吸附劑活性太低，分離效果不好，可通過“活化”來提高其活性。所謂“活化”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過程。通常是將吸附劑裝在瓷盤里放進烘箱中恒溫加熱。“活化”的溫度和時間應根據(jù)分離需要而定。氧化鋁一般在200℃恒溫4h，硅膠在105～110℃恒溫0.5～1h。“活化”完畢，切斷電源，待溫度降**接近室溫時，從烘箱中取出放進干燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些。
此外，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團，對微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素、淀粉或糖類作吸附劑?；钚蕴际且环N吸附能力很高的吸附劑，但因粒度太小而不常用。
(3)淋洗劑
淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡稱溶劑。其極性大小和對被分離物各組分的溶解度大小對于分離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強烈吸附，從而將原來被吸附的待分離物“頂替”下來，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠小于各組分的極性，則各組分被吸附劑強烈吸附而留在固定相中，不能隨流動相向下移動，也不能達到分離的目的。如果淋洗劑對于被分離物各組分溶解度太大，被分離物將會過多、過快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會造成譜帶分散，甚***不能分開。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同，第99～100頁給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，首先在薄層層析板上試選(見圖3-40)，初步確定后再上柱分離。如果所有色帶都行進甚慢則應改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑，直**獲得滿意的分離效果。
